Le retour à la paix est précaire. Les tensions occasionnées par l’application de l’édit d’Amboise ne sont pas réglées avec le nouveau traité de paix. De plus, le pouvoir royal profite du répit pour changer radicalement d’orientation. La politique de compromis défendue depuis 1561 au moins est alors abandonnée, comme le montre l’éviction du chancelier Michel de L’Hospital, contraint de rendre les sceaux en septembre 1568. Le 23, Charles IX signe l’ordonnance de Saint-Maur-des-Fossés qui, tout en maintenant la liberté de conscience, défend « tout exercice d’autre religion que de la catholique et romaine ». Ce retour de l’intransigeance qui s’accompagne de création de « milices » ultra-catholiques destinées à « extirper l’hérésie », amène les protestants à reprendre les armes dans le Sud-Ouest, où ils répondent aux appels lancés par Jeanne d’Albret. C’est le début de la troisième guerre au cours de laquelle La Rochelle devient le quartier général des troupes huguenotes, ce qui explique que les affrontements aient essentiellement été circonscrits au Poitou et à la Saintonge. Battus à Jarnac le 13 mars 1569 où leur chef Condé est tué, les protestants gagnent la bataille de La Roche-l’Abeille en juin. De nouveau défaits le 3 octobre 1569 lors de la bataille de Moncontour, les protestants désormais menés par Coligny, réussissent néanmoins à rejoindre les troupes de Gascogne et à remonter le long de la vallée du Rhône sans que les royaux puissent les arrêter. Charles IX et Catherine de Médicis adoptent de nouveau une attitude modérée afin de mettre fin au conflit. L’édit de Saint-Germain est signé le 8 août 1570.